反相高效液相色谱法：测定藏药材中金丝桃苷含量

【摘要】 目的建立藏药材红毛五加药材中金丝桃苷的含量测定方法并比较其不同药用部位及不同产地、不同采收期的红毛五加皮中金丝桃苷的含量。方法Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）,柱温30℃，流动相甲醇（A）-0.5 %磷酸水溶液（B）,梯度洗脱，程序为：基线（A∶B=30∶70）,0～5 min（A∶B=35∶65）,5～15 min（A∶B=40∶60）,15～30 min（A∶B=50∶50）;检测波长 358 nm,流速1 ml·min-1。结果金丝桃苷在2.90×10-3～0.58 μg范围内峰面积与进样量具有良好的线性关系,回归方程 Y =4×106X-14 065，r=0.999 9（n=9），平均回收率为100.6 %，RSD为0.96 %（n=6）。结论该法简便、准确、重复性好,有助于红毛五加质量控制方法的研究。

【关键词】 红毛五加;金丝桃苷;反相高效液相色谱

Abstract：ObjectiveTo develop an RP-HPLC method for determination of Hyperoside in Acanthopanax giraldii Harms, ａnd to determine the contents of Hyperoside in different parts, different areas ａnd different collection time of Acanthopanax giraldii Harms. MethodsThe analysis was carried out at 30 ℃ on a Kromasil C18 column eluted with a mobile phase consisted of methanol（A）-0.5 %phosphoric acid（B）. The gradient elution was as following:ⅰ The ratio of A ａnd B was 35/65 from 0 to 5 min. ii The ratio of A ａnd B was 40/60 from 5 to 15 min.ⅲ The ratio of A ａnd B was 50/50 from 15 to 30 min.The detective wavelength was at 358 nm with the flow rate of 1.0 ml/min. ResultsThe calibration curve was linear within the concentration range of 2.90×10-3～0.58 μg with r of 0.999 9（n=9）.The average recovery was 100.6% ａnd RSD was 0.96% （n=6）.ConclusionThis method is simple, accurate ａnd reproducible. It is useful for quality control of Acanthopanax giraldii Harms.

Key words：Acanthopanax giraldii Harms ; Hyperoside ; RP-HPLC

藏药材红毛五加为五加科五加属植物Acanthopanax giraldii Harms的干燥茎皮。《中国药典》尚未收载红毛五加药材。在文献报道中发现刺五加中含有金丝桃苷成分[1]，金丝桃苷对钙内流有较强的选择性阻滞作用，并对心肌有保护作用，对脑缺血损伤也有保护作用，调节免疫作用，临床上主要用于治疗心脑血管疾病、抗菌、抗炎、止咳、平喘、祛痰等，且疗效突出，应用前景十分广阔[2]，这与红毛五加皮的对心血管系统、免疫系统、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等药理作用[3]相一致。红毛五加与刺五加为同科同属植物，目前作者尚未查阅到红毛五加中有关金丝桃苷的研究。四川为红毛五加药材的主要产区，其传统的入药部位为茎皮，本课题组的前期研究表明其茎皮中其它有效成分的含量较高[4～8]。本实验拟采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法考察比较红毛五加不同药用部位、不同产地和不同采收期的红毛五加皮中金丝桃苷的含量，以期为红毛五加药材的质量控制、最佳采收期的确定、资源的合理利用提供参考。

1 仪器与材料

Waters2695高效液相色谱仪，Waters2996检测器,Empower色谱工作站。金丝桃苷（批号111521-200303，中国药品生物制品检定所，含量测定用）;甲醇为色谱纯;水为二次重蒸水;其余试剂均为分析纯。9个不同产地的红毛五加药材样品采自四川省境内，经刘圆教授鉴定为五加科五加属植物Acanthopanax giraldii Harms的干燥茎皮。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Krosmasil C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm），柱温30℃。流动相为甲醇（A）-0.5 %磷酸水溶液（B）,梯度洗脱，程序为：基线（A∶B=30∶70）,0～5 min（A∶B=35∶65）,5～15 min（A∶B=40∶60）,15～30 min（A∶B=50∶50）;检测波长358 nm,流速1 ml·min-1。金丝桃苷峰可以达到基线分离，峰形对称，分离度好，按照金丝桃苷峰计，理论塔板数不应低于5 000，对照品溶液及红毛五加样品溶液的高效液相色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取金丝桃苷对照品适量，加甲醇配置成29.00 μg·ml-1的溶液。

2.2.2 样品溶液的制备

称取红毛五加药材粉末（过40目筛）约2 g，精密称定，置圆底烧瓶中加入石油醚溶液25 ml，称定重量，加热回流1 h，取出，过滤，弃去滤液，挥去溶剂，滤渣中加入25 ml甲醇，称定重量，回流2 h，取出，冷却至室温，用甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45 μm的微孔滤膜，作为样品溶液。

2.3 线性关系的考察

分别精密量取上述对照品溶液0.1，0.5，1，2，4，6，10，20 μl，在上述色谱条件下测定峰面积。以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y =4×106X-14 065，r=0.999 9（n=9）。结果表明金丝桃苷在2.90×10-3～0.58 μg范围内峰面积与进样量具有良好的线性关系。

2.4 精密度实验

精密吸取对照品溶液10 μl，重复进样5次，测得峰面积的RSD为0.96 %（n=6）。结果表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性实验

精密量取样品溶液10 μl，分别于0，2，4，6，8 h测定。按照金丝桃苷对照品峰面积计算RSD为0.57%（n=6）。结果表明样品溶液在配制后8 h内稳定。

2.6 重复性实验

取红毛五加皮样品约2 g，精密称取6份 ,按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定金丝桃苷的含量。结果样品中金丝桃苷的量均值为99.68 μg/g，RSD为1.12%（n=6）,表明重复性良好。

2.7 加样回收率实验

精密称取9份已知含金丝桃苷量的药材粉末2.0 g，依次加入低、中、高3种质量浓度金丝桃苷对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定。结果平均回收率为100.6%，RSD为0.96%（n=9）。

2.8 样品测定

精密称取红毛五加的不同药用部位及不同产地、不同采收期的红毛五加皮（过40目筛）2 g。按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件测定。结果见表1～3，色谱图见图1。表1 红毛五加不同部位金丝桃苷的含量（略）表2 不同产地红毛五加皮中金丝桃苷的含量（略）表3 不同采收期红毛五加皮中金丝桃苷的含量（略）

从实验结果来看，红毛五加各部位中叶中金丝桃苷的含量最高: 645.31 μg/g;四川阿坝茂县的红毛五加皮中金丝桃苷含量明显高于其他产地，为179.42 μg/g;6月份的红毛五加皮中金丝桃苷含量最高，为112.03 μg/g。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

以流动相作溶剂，在200～400 nm波长范围内测定了金丝桃苷对照品的紫外光谱图，结果在256 nm 和358 nm波长处有最大吸收，确定358 nm为检测波长。

3.2 提取方法的选择

实验中曾分别考察了用甲醇作为提取溶剂超声0.5 h[9]，超声1 h[10]，醋酸乙酯索氏提取[11]以及石油醚先脱脂，再加甲醇回流的提取方法[12]等4种方法测定同批试样的含量，经比较最后一种方法提取的最为完全，故采用石油醚先脱脂，再加甲醇回流的提取方法。

3.3 流动相的选择

实验曾考察了乙腈-0.05 %磷酸水溶液（16∶84）[13]、甲醇-0.1%磷酸溶液（40∶60）[10]、甲醇∶0.2 %磷酸溶液（45∶55）[14]为流动相，金丝桃苷的保留时间相对短些，但不能与其它化合物很好地分离。采用本文选择的梯度洗脱，可以达到基线分离，峰形对称，分离度好。

3.4 不同入药部位药效成分含量

从入药部位来看，藏药材红毛五加的叶中金丝桃苷的含量最高，明显高于红毛五加皮中金丝桃苷的含量，与结合本课题组的前期研究成果相一致[15]，但是红毛五加叶能否同等入药，还需要进行更多化学成分分析和药理实验研究。

3.5 不同产地或采收期药效成分含量

从不同产地来看，采自四川阿坝藏族羌族自治州茂县的红毛五加皮中金丝桃苷含量明显高于其它产地。从不同采收期来看，6月份的红毛五加皮中金丝桃苷含量最高。从实验结果来看，红毛五加药材中金丝桃苷的含量除叶以外，其它含量值均低于0.05%，但仍为其质量评价提供了一定的科学依据。