油菜籽硫甙的测定－光度法

1．范围

本标准规定了采用光度法测定油菜籽中硫甙含量的方法。

本标准适用于油菜常规育种、杂交三系、两系育种、辐射育种以及生物技术选育中芥酸硫甙含量检测以及油菜种子和商品油菜籽收购过程中硫甙含量快速测定。

2．原理

利用酶的专一性，油菜籽中硫甙与特异性酶（Gln MEN）反应后，生成产物与专用显色剂（Chrom G）反应形成有特征吸收峰的有色产物，根据标准曲线测定硫甙含量。

3．试剂

除特殊标明外，所有试剂均为分析纯（A.R）,水为GB/T6682规定的二级水。

3.1 硫甙测定A液。

3.2 硫甙测定B液。

3.3 硫甙测试板。

4．仪器设备

实验室常规仪器及下列各项。

4.1 微型粉碎机。

4.2 电子天平（量程 0-200 g，最小读数100 mg）。

4.3 40-200 μL微量移液器。

4.4 1000 μL微量移液器。

4.5 脱脂棉。

4.6 石英比色杯（18 mm×18 mm）。

4.7 芥酸硫甙速测仪。

5．取样

按照GB5491扦取油菜籽样品，取样时，应清除样品外来杂质。

6．操作步骤

6.1 试样的制备

按照GB5491对扦取的油菜籽样品进行缩分，取其中一份样品约10 g在微型粉碎机中粉碎20秒，将粉碎物混匀，再粉碎5秒（亦可用研钵将样品研碎过40目筛）。

6.2 称样

准确称取0.50 g（精确到100 mg）样品于5 mL具塞试管中。

6.3 提取

用移液管加入3 mL硫甙测定A液，盖紧盖子，用力摇动试管，混匀后反应8分钟(中途再混匀两次)。

6.4 过滤

用玻璃棒将蓬松、纹路一致、适量的脱脂棉缓缓塞入试管中，当脱脂棉接触液面后，将试管平放桌面上，让脱脂棉自动吸液，吸满后，竖起离心管再用玻璃棒将脱脂棉往下轻压，至滤出清液为止，也可采用离心或滤纸过滤得到上清液。

6.5 酶－显色反应

取出密封保存的硫甙测试板（可分条取用，其它密封，避光保存），用微量移液器取50 μL 上清液于测试板孔中，同时选一孔加入50 μL硫甙测定B液作为空白；酶解反应8min，中途用吸耳机吹气两次，使酶解反应均匀一致。

6.6 显色液稀释

用微量移液器取150 μL硫甙测定B液，分别加入空白孔及样品孔中，继续反应2min，中途吹气一次，使体系均匀稳定。

6.7 测定

在芥酸硫甙速测仪上，以试剂空白作零点，选择“仪器校准”，记忆零点值，然后选择“样品测量”，即可进行样品测试分析，读数值即为每克油菜饼粕中所含硫甙总量的微摩尔数（μmol／g）。

7．精密度和允许误差

重复测定相对标准偏差小于6％；两次平行测定结果芥酸相差小于0.8%；两次平行测定结果硫甙相差小于4.0μmol/g。测定结果用算术平均值表示。