蛋白质测定方法
蛋白质测定方法一般来说,有以下五种:凯氏定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)、紫外吸收法和考马斯亮蓝法(Bradford法)。
表 五种蛋白质测定方法的比较
方法
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灵敏度
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时间
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原理
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干扰物质
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说明
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凯氏定氮法
(Kjedahl法)
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灵敏度低,适用于0.2~ 1.0mg氮,误差为 ±2%
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费时
8~10小时
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将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定
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非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离)
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用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长
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双缩脲法(Biuret法)
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灵敏度低
1~20mg
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中速
20~30分钟
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多肽键+碱性Cu2+®紫色络合物
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硫酸铵;
Tris缓冲液;
某些氨基酸
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用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似
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紫外吸收法
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较为灵敏
50~
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快速
5~10分钟
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蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收
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各种嘌吟和嘧啶;
各种核苷酸
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用于层析柱流出液的检测;核酸的吸收可以校正
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Folin-酚试剂法(Lowry法)
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灵敏度高
~
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慢速
40~60
分钟
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双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原
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硫酸铵;
Tris缓冲液;
甘氨酸;
各种硫醇
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耗费时间长;操作要严格计时;
颜色深浅随不同蛋白质变化
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考马斯亮蓝法(Bradford法)
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灵敏度最高
1~
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快速
5~15分钟
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考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm
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强碱性缓冲液;
TritonX-100;
SDS
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最好的方法;
干扰物质少;
颜色稳定;
颜色深浅随不同蛋白质变化
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从以上表格中可以得出,不同的方法有不同的特点和优势,如紫外吸收法测定时间快。但是综合起来,最后一种考马斯亮蓝法(Bradford法)效率最高,无论是测定时间,灵敏度还是受干扰程度,都是比较占优势的。
下面,我们来重点介绍一下其中一种蛋白质测定方法--凯氏定氮法。
凯氏定氮法(Kjedahl法)
首先将浓硫酸倒入样品中,边倒边摇晃,以使浓硫酸与样品充分接触,然后加热试剂。如果你需要加快实验进度,可以加入CuSO4作催化剂,这样,实验的反应时间就会大大缩短。CH2COOH和H2SO4反应生成氨气,然后氨气又与H2SO4发生作用,固定了氮元素。这时我们得到了(NH4)2SO4的溶液,然后我们可以用NaOH去跟硫酸铵反应,通过计算NaOH的使用量,就可以计算出氮的含量。下面是整个定氮法中发生的化学反应。
CH2COOH+ 3H2SO4 = 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
2NH3 + H2SO4= (NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4 + 2NaOH =2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
当我们得到氮的含量以后,我们就可以通过一定的计算,最终算出蛋白质的含量。
凯氏定氮法常用于有机化合物中的氮含量的测定,是蛋白质含量测定的经典方法,虽然在测试过程中,试剂用量很大,但是,不可否认,它所适用的样品范围之广,测试结果之精确,都是公认的。
现在,随着科技的发展,我们已经研究出带消化炉的凯氏定氮仪,它把定氮过程中的前两步骤通过仪器完成,方便了整个过程的实施。凯氏定氮仪能够自动的对样品进行消化,然后蒸馏,智能化完成,节省了时间和精力,提高了工作效率。这种蛋白质测定方法具有有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点。浙江托普仪器有限公司提供这种产品,24小时服务热线:0571-87515059。
图 凯氏定氮仪
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