酶抑制法快速检测有机磷农药残留的研究进展

农药作为重要的农业生产资料,在农产品生产中对病、虫、草、鼠害的防治起到了非常重要的作用,为人类创造了巨大的经济效益,但同时也给环境安全和人体健康带来了一定威胁. 在农业生产中应用的杀虫剂农药主要可分为四大类:第一类是有机氯杀虫剂,这类杀虫剂由于致畸、致癌和致突变等缺点,已停止生产和使用;第二类是有机磷杀虫剂;第三类是氨基甲酸酯类杀虫剂;第四类是拟除虫菊酯类杀虫剂. 在所有的农药中,有机磷农药主要是杀虫剂,由于其品种多、防治对象多及杀虫效率高等特点,而在各种农作物尤其是水果蔬菜生产中得到最广泛的应用 . 有机磷农药中的部分品种具有高毒性的特点,大量使用会造成环境污染、作物药害及人畜中毒. 据世界卫生组织统计,全世界每年农药中毒人数约300 万人,其中有机磷农药中毒占70 %. 我国专家对为数众多的农药品种进行分级排队,从中筛选出的十种强污染农药中,有七种属于有机磷类,可见,农药残留检测的重点应该放在有机磷类杀虫剂.目前,我国农药残留快速检测技术应用最多的是酶抑制法,其较高的专一性、灵敏性和准确性及低成本等优点已受到人们的广泛关注. 笔者主要针对乙酰胆碱酯酶和植物酯酶两种酶在快速检测有机磷农药残留中的应用研究作一综述.

1. 1 　有机磷农药的特点

早在20 世纪30 年代,德国的Schrader 就合成了一系列有机磷酸酯类化合物,并发现其中一些具有杀虫杀螨活性. 目前全世界有机磷杀虫剂的品种约为100 余种,常用的有50 多种. 我国农药市场上有机磷品种30 余个,占我国杀虫剂品种的38 % ,而产量却占75 %. 有机磷杀虫剂作为我国使用最广泛、用量最大的一类杀虫剂,有机农药一般都会残留在土壤、或饮用水中，然后通过生物链进入植物、动物体内，再到人体内。那么如何去测定土壤中农药的残留量，我们可以通过测土仪来测定。它可以测出氮、磷的含量，从而推断出是否含有农药成分。农药品种繁多,性能也千差万别. 综合起来主要具有以下几个方面的特点:

(1) 在自然环境和动植物体内易降解. 正确使用时残留问题小,不致污染环境且在高等动物体内无累积毒性; (2) 杀虫效率高,广谱,作用方式多样(如触杀、胃毒、熏蒸) ; (3) 毒性差异大. 辛硫磷、马拉硫磷及敌百虫等毒性低,而对硫磷、甲拌磷为剧毒品种.总的来说,有机磷杀虫剂的毒性偏高; (4) 易解毒.对有机磷杀虫剂引起的急性中毒有特效的解毒药,如解磷定和阿托品; (5) 与有机氯农药、拟除虫菊酯类杀虫剂相比,害虫对有机磷杀虫剂的抗药性发展缓慢.

1. 2 　有机磷农药的毒性

作为典型的酶毒剂,有机磷农药可以通过消化道摄入,也可以通过皮肤、粘膜、呼吸道吸收. 有机磷的急性毒性主要归因于对胆碱能神经突触后膜上的乙酰胆碱酯酶活性的抑制,使酶不能起催化乙酰胆碱水解的作用,导致组织中能使神经过度兴奋的乙酰胆碱过量蓄积. 这种乙酰胆碱传导介质代谢紊乱,可导致迟发性神经毒性,引起运动失调、昏迷、呼吸中枢麻痹、瘫痪甚至死亡. 有实验证明对氧磷和对硫磷酰化人脑胆碱酯酶一般约经4 d 即“老化”,酶活不易再恢复.

目前检测有机磷农药残留普遍采用的方法有:色谱法、波谱法和酶抑制法. 色谱法检测准确,灵敏度高,但成本高,测定时间长,且需要具有一定技术水平的专业人员才能进行操作,只适合在实验室分析;波谱法干扰因素多,灵敏度不高,易出现假阴性结果,一般只能作为鉴别方法粗选;酶抑制法具有操作简便,速度快,适合现场检测和大批样品筛选检测和我国小规模、分散的销售体系中经常性的现场快速检测,因此作为一种检测农药的常用方法得到广泛应用. 而如何选择酶源是实现快速、准确检测的关键.

2. 1 　酶的来源

胆碱酯酶广泛存在于动物的组织中,1953 年stedman 等首先从马血清中分离出乙酰胆碱酯酶,此后不同来源的乙酰胆碱酯酶相继得到纯化和研究 . 目前已分离纯化的动物来源的乙酰胆碱酯酶主要集中在动物肝脏和血液,如猪肝,鸡血等. 也有利用蚯蚓以及海洋鱼类,甲壳类动物的神经组织,脑组织分离乙酰胆碱酯酶. 近年来很多学者致力于从昆虫体内提取乙酰胆碱酯酶如:家蝇、麦二叉蚜、黄猩猩果蝇、烟草天蛾、光叶库蚊、黄粉甲、美洲淤夜蛾、豆荚草盲蝽、马铃薯叶甲、骚扰角蝇及棉铃虫等. 迄今为止,酶抑制法进行农药残留检测以从敏感家蝇中提取的乙酰胆碱酯酶效果最佳,其敏感性优于其他来源的乙酰胆碱酯酶,更有进一步研究表明,家蝇羽化后2～3 d 时其头部的乙酰胆碱酯酶敏感性最高.植物来源的酯酶作为农药残留检测的三种酶标记物之一,由于其来源广泛、价格低廉,近年来得到了较多的关注. 但是,几乎所有的研究都是直接以面粉作为酶源,筛选用于农残检测的最佳小麦品种或者是以面粉作为酶标记物,制成酶片,对酶片检测农残显色反应的温度、时间、显色剂的选择等方面进行比较研究. 尚未见到用提取纯化的纯酯酶制品对大量有机磷农药的敏性和最低检测限进行研究的报道.

2. 2 　两种酶抑制法的比较研究

酶抑制法测定有机磷农药残留是根据有机磷农药的毒性对酶分解底物的抑制作用进行的,其酶源有来自动物的胆碱酯酶和从植物中提取的植物酯酶.动物胆碱酯酶法是基于有机磷农药的毒性抑制乙酰胆碱酯酶催化底物水解生成乙酸和胆碱,后者与5 ,52二硫代2双222硝基苯甲酸反应,生成黄色产物52硫代222硝基苯甲酸,其在410 nm 处有最大吸收,测定其在单位时间内的生成量,即可测得乙酰胆碱酯酶的活性.植物酯酶可以催化乙酸萘酯水解为萘酚和乙酸,萘酚与显色剂固蓝B 作用形成紫红色的偶氮化合物,从而发生显色反应。

有机磷农药能抑制植物酯酶的活性,使反应速率发生变化,紫红色的偶氮化合物产量不同,吸光度值也不同,即酶的活性受到抑制的程度不同.很多学者经过大量实验,比较了动物酯酶和植物酯酶反应的条件、总酯酶活力和灵敏度,并对其检测条件进行了优化,如2004 年黄志勇等比较了快速测定蔬菜中有机磷农残的胆碱酯酶抑制法和植物酯酶抑制法,结果发现两种酶抑制快速测定方法均可用于蔬菜中有机磷农残的测定,其加标回收率都达到85 %以上,但植物酯酶法的测定偏差小于3 %,精密度较前者更胜一筹. 而后对植物酯酶和动物酯酶在不同p H 值下的酶活、抑制程度等性质进行的实验研究也表明了动物酯酶中的苍蝇酶、蝇蛆酶与植物酯酶中的小麦酯酶相比,它们的活力和被农药抑制程度处于相近的水平,苍蝇酯酶在p H 为6. 5时抑制程度最大为71 % ,植物酯酶在p H 为6. 0 时抑制程度达到了73 %. 植物酯酶抑制法对久效磷、乐果及辛硫磷的最低检出限范围为0. 03～0. 40mg/ kg ,而动物酯酶抑制法对相应农药的最低检出限为0. 04～0. 50 mg/ kg . 可见,植物酯酶与动物酯酶均可用于蔬菜中有机磷农药残留的快速测定,与动物酯酶相比,植物酯酶的酶活、抑制程度等各项指标均不逊色,且具有来源方便、成本低的优势.

2. 3 　动物胆碱酯酶法

自从1951 年发现有机磷农药在体外也能抑制胆碱酯酶以来,绝大多数研究都是基于动物胆碱酯酶这一原理进行的. 目前,胆碱酯酶法检测有机磷的方法主要有酶片法、酶抑制分光光度法以及胆碱酯酶生物传感器法.

2. 3. 1 　酶片法

酶片法是将敏感生物的胆碱酯酶和生色基质液经固化处理后加载到滤纸片或类似载体物质上,基质在胆碱酯酶的催化作用下迅速分解,生成胆碱(蓝色) 和乙酸. 有机磷和氨基甲酸酯农药对胆碱酯酶有抑制作用,使催化、水解、变色的过程发生改变. 若胆碱酯酶受到抑制,基质就不能水解、不变色,表明样品中含有机磷和氨基甲酸酯类农药(呈阳性) . 目前广泛使用的速测箱、速测卡法均属于酶片法.近年来国内常见的用固化含有胆碱酯酶和靛酚乙酸酯试剂的试纸片建立的适合我国蔬菜中部分农药残留限量的现场监督检测的速测卡法,其检出限一般在0. 3～3. 5 mg/ kg ,检出时间为15 min 操作简单,速度快,测试成本低廉. 也有学者利用马血清中的乙酰胆碱酯酶与底物氯化乙酰胆碱作用,根据反应前后的p H 值变化及指示剂的颜色变化情况,建立的一种可以作定性及半定量分析的酶片快速检测法,应用于实际检测黄瓜中农残的效果较好. 在国外方面,Hwa2Young No 和Young Ah Kim等用涂有乙酰胆碱酯酶的试纸检测样品中农药残留的含量,实验表明以Hybond N + 为酶载体,苯基乙酸酯为底物最合适,此时有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限分别为10 - 6 ～102 μg/ mL 和10 - 6 ～100μg/ mL ,实验还发现:与对氧磷相比,试纸法对被氧化的对氧磷更敏感.

2. 3. 2 　酶抑制分光光度法

有机磷类农药对乙酰胆碱酯酶活性有抑制作用,浓度越高,抑制率越高. 通过分光光度计测定吸光度随时间的变化值,并与空白对照比较求得酶抑制率,从而判定样品中是否有有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在. 该法所需仪器设备简单、灵敏度高、前处理简单、检测时间短, 可及时检测含农残的蔬菜.曾有报道以鸡脑为酶源提取乙酰胆碱酯酶,利用酶抑制分光光度法检测油白菜中有机磷农药(对硫磷、辛硫磷、氧化乐果) 的残留量,可使3 种农药的回收率分别达到97 % , 101 %和99 %. IngridWalt 等从镰刀菌pisi 中提取角质酶,利用酶抑制分光光度法和96 孔板法同时检测多个样品中有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的含量,该法对毒死蜱和对氧磷的检测限分别为2. 6 mg/ L 和0. 04 mg/ L .

2. 3. 3 　胆碱酯酶生物传感器

胆碱酯酶生物传感器法是目前农药残留速测技术中的研究热点,其在研究方法多样化、灵敏度、准确性、响应时间等方面都具有很大优势.

(1) 电化学型:电化学型生物传感器是基于胆碱酯酶催化底物水解生成电活性物质的反应而构建. 通常采用电化学氧化法直接测定生成的巯基胆碱或者先用胆碱氧化酶氧化生成的胆碱,进一步用电化学方法测量在此催化氧化过程中消耗的O2 或生成的H2O2 . Andreescu 等以果蝇中提取的胆碱酯酶为酶源,以苯乙酸酯为底物,Ag/ Al 参考电极,研制了一种丝网印刷电化学传感器,其对对氧磷和毒死蜱的检测限分别为5. 2 ×10 - 3 mg/ L 和0. 56 ×10 - 3 mg/ L .

(2) 光化学型:构建光化学型生物传感器的基础是胆碱酯酶催化底物水解生成光活性物质的反应. 在酶水解底物乙酰胆碱过程中,生成的乙酸引起溶液p H 降低,可引起p H 指示剂溴甲酚紫的颜色变化. 根据这一原理,已构建了一种具有三层生物活性膜的“三明治”型生物传感器. 胆碱酯酶被固定在外层的经亲水修饰的聚偏氟乙烯膜上,中间层为同溴甲酚紫混在一起的溶胶凝胶层, 下层为玻璃片. 同样,也有根据溶液p H 降低引起p H 指示剂氯酚红颜色变化的原理,将AChE 及氯酚红分别共价固定在可控多孔玻璃球上,建立了一种流动式注射分析方法. Pardo2Yissar 等则设计了一种AChE 与经化学修饰的CdS 纳米离子相结合的光电流传感系统. 在AChE 抑制剂存在情况下,AChE的催化活性受到抑制,水解产物巯基胆碱的量降低,引起光电流减小. 这种酶与CdS 纳米离子联合的光电流传感系统有可能发展为一类通用的生物传感模式.

(3) 压电型:设计压电型生物传感器的基本思路就是将胆碱酯酶(ChE) 或其抑制剂固定于石英晶体表面,当待测的ChE 及其抑制剂与所固定的识别物相互作用而产生特异结合时,将导致晶体表面质量负载的改变,通过传感器的频率变化加以检测.Abad 等采用直接吸附和共价结合两种方式将AChE 固定在石英晶体表面制成压电生物传感器.利用有机磷抑制固定化的AChE 与吲哚乙酸生成不溶性靛蓝染料的反应,测定压电晶体的振荡频率的变化. Makower 等建立了一种竞争亲合分析法,对氧磷作为识别元件通过螯合作用被固定在压电传感器金电极的表面. 经过对氧磷修饰后的表面可以同BChE 结合,当样品中存在杀虫剂时,电极表面结合的BChE 量就会减少 . ChE 可以与可卡因类化合物相结合,酶催化速率水解常数非常小. 基于此,Knosche 等将可卡因的衍生物苯甲酰爱冈宁(benzoylecgonine) 固定在压电晶体表面,并研究了其与AChE 结合的动力学特性,结果表明,苯甲酰爱冈宁可作为亲和配基用于生物传感分析.Nunes 等制成了胆碱酯酶(ChE) 的电流型生物传感器,可用于谷物等样品中氨基甲酸酯类杀虫剂涕灭威、西维因、灭多虫和残杀威的测定,测定线性范围为5 ×10 - 5μg/ g ,检测限为1 ×10 - 4 ～3. 5μg/ g.Holger Schulze 等将AchE2传感器直接应用于以N2溴代丁二酰亚胺为氧化剂,以异辛烷为萃取剂萃取的植物样本,此法检测时间为2 h ,重复率为84 %,对氧磷的检测限可达2 μg/ kg ,达到欧盟食品农药残留的安全限值。

2. 4 　植物酯酶抑制法

酶法快速检测农药残留的方法中,多采用敏感家蝇头部获得的乙酰胆碱酯酶,但是动物酯酶常表现为保持期短,需冷冻低温保存. 而植物酯酶酶源丰富,提取和保存较为方便,只需以一定比例的水或缓冲液混合离心获得的上清液即可作为粗酶液,并在- 4 ℃保存即可. 而且与动物酯酶相比,植物酯酶抑制法的测量准确度和精密度均不逊色,能达到快速检测农药残留的目的.

1987 年,中国农业部环保所研制出一种酶片和显色基质片,不需仪器,即可在田间或菜市场快速测定蔬菜和水果中的有机磷类农药,其检测限为0. 5～10 mg/ kg. 而后有人利用自制的植物酶片和高灵敏度化学检测液(速测灵) ,使检测出有机磷农药残留的灵敏度达到0. 4～10 mg/ L 和0. 18～10 mg/kg ,检测时间为5～10 min ,检测成本为0. 2～0. 3元人民币. 至此,植物酯酶法检测有机磷农药残留开始受到了研究学者的广泛关注,各方面的研究也随即展开.

在酶源的筛选方面,依据对有机磷农药的敏感性而定,许多研究者直接从面粉中提取酶,但不同的小麦酶对农药的敏感性不同即使对于同一品种小麦,产地不同、种植方法不同、所处生长期不同时,其对农药的敏感度也会存在较大差异. 因此,需要作进一步的研究,以确定可以进行定量分析而且具有互换性的植物酯酶酶源.

在显色液方面,由于酶抑制法检测农药残留常需借助于固蓝B 盐和乙酸萘酯组成的生色基质液的显色完成. 但该显色液非常不稳定,在室温下40min 以后显色能力大大下降,不能再用来测定,需现用现配,这给检测工作带来了诸多不便. 为此,董剂,大大延长了显色剂的有效使用期限,使其在室温下放置3 个月后性能不变,且该法对甲胺磷、敌敌畏、对硫磷及辛硫磷等的检出体积分数为10 - 4 ～10 - 7 . 也有学者改用其它显色剂如2 ,62二氯乙酰靛酚,先用植物酯酶水解橙色的2 ,62二氯乙酰靛酚,然后用分光光度法测定分解的靛酚(蓝色) 吸光度,计算可得有机磷的含量,该法对常用的几种有机磷及氨基甲酸酯类农药的测定限均在0. 001 5～0. 3300 mg/ L 范围内. 通过进一步实验比较两种不同显色剂(2 ,62二氯靛酚乙酯和固蓝B 盐) 的显色原理与性能,证实了采用2 ,62二氯靛酚乙酯既兼顾了底物和显色剂的双重作用,且从显色底物液使用的方便程度、稳定性以及便于现场快速检测等方面看,使用2 ,62二氯靛酚乙酯显色剂比用固蓝B 盐来显色更具有优越性.

进一步研究还发现了小麦酯酶活性与保存温度的关系:在20 ℃储存5 d 酶活只剩39. 6 %,在4 ℃储藏5 d 剩余75. 6 %,酶活衰退较快,而将该酶用液氮在- 196 ℃保存8 d ,酶活仍有97. 5 % ,可见酶的保存需要较低的温度. 近年来研究人员主要利用酶固定化技术解决酶液难以贮藏的问题,如用离子交换树脂作为固定化载体对植物酯酶进行固定化,不仅可使酶的稳定性大大提高,而且与游离酯酶相比,对农药抑制的响应敏感性也有明显的提高.也有选用聚苯乙烯微孔反应板作为酶的载体,将自制的植物酯酶固定在载体上的微孔内壁表面,制成农药快速检测板,检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的灵敏度可达0. 01～0. 1 mg/ kg . 最近有报道采用原位溶胶2凝胶法制备PVA/ SiO2 有机/ 无机杂化溶胶,并将显色剂和植物酯酶分散于溶胶中,制成一类亲水2亲丙酮可调,贮存性好的传感膜. 固定于该杂化膜中酶的稳定性在冷藏和室温条件下均比在溶液状态下有明显提. 由此可见,酶的固定化方法在检测农药残留中将起到非常重要的作用.

随着人们对蔬菜中农药残留及食品安全性问题的关注,只有不断地更新和完善农药残留的快速检测技术,才能满足人类对健康和食品贸易的要求. 而酶抑制法检测有机磷农药残留相对于传统的波谱法,色谱法在简便、快速和检测成本等方面都有较大的优越性. 基于动物胆碱酯酶的酶片法、分光光度法以及生物传感器法,准确性和灵敏度尚好,其中近年来的研究热点———生物传感器法,我国还停留在研发阶段,应着力解决其稳定性、精确性等问题尽快将研究成果投入实际运用. 而相对于动物酶法,植物酯酶法在提取、保存、检测成本上更胜一筹,且灵敏度和准确性上也不逊色,故在我国推广很快. 但是不同的植物酯酶对有机磷农药的抑制强度不同,应探索更有效的分离纯化方法并对其结构进行研究,明确作用靶标部位,以期更大程度地提高植物酯酶的检测灵敏度. 同时,应着力研制便宜、简便和准确的速测仪器, 力求把残毒超标的蔬菜、水果堵在食用之前.