SSR分子标记技术及其在构建玉米DNA指纹库上的应用

SSR分子标记技术及其在构建玉米DNA指纹库上的应用

康丽丽 周鸿飞(沈阳农业大学农学院)

玉米是一种重要的饲用、粮用和工业加工作物，在国民经济中占有重要的地位。玉米育种方法的改进对农业发展具有重要意义。长期以来，育种家们大多数是借用易于鉴别的形态学和同工酶等遗传标记来辅助育种，并取得了很大成功。但这类标记的最大不足之处在于其数量有限，要找到与目标性状密切相关的标记往往很困难，难以应用于育种实践。因此，育种家们一直希望能够找到一类数量丰富、选择效应高的标记，以提高育种效率和育种过程的预见性。随着分子生物学的发展，开发了基于DNA变异的分子标记。应用最广泛的主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP等，其中SSR标记是一种共显性标记，重复性好，可靠性高，分析简便，易于实现自动化，而且灵敏度高，检测遗传变异的能力强。近年来，SSR标记在玉米育种中得到了广泛的应用。

1 SSR标记

1．1 SSR标记的原理

简单重复序列(Simple sequence repeat.SSR)，又称为微卫DNA(Microsatellite DNA)。微卫星通常是指以2—4个核苷酸为单位多次串联重复的DNA序列，也有少数以l一6个核苷酸为串联重复单位。微卫星在基因组中的分布是随机的，它可以存在于内含子、外显子及染色体的其它任何区域。在不同植物中，微卫星重复单位的碱基组成及拷贝数随物种的不同而有所差异，但人们发现微卫星两端的序列是保守的。因此，可以设计出与微卫星两端保守序列互补的引物，通过PCR扩增重复序列本身并通过凝胶电泳检测其多态性。SSR序列多态性的出现是由于同一物种中不同基因型的寡核苷酸重复次数不同以及重复序列在染色体复制时的滑动或染色单体的不等交换造成的。因此，微卫星可用作分子标记。由于玉米中存在转座子，微卫星的多态性表现得极为丰富，所以，通过特异性引物进行PCR扩增反应、琼脂糖凝胶电泳(或聚丙烯酰胺凝胶电泳)、放射自显影(或银染)和GeneScan技术等，就可以检测到在简单重复序列重复单位数不同的DNA区域的多态性，这也是SSR技术较其它几。种分子标记技术更适合于玉米研究的原因之一。

1．2 SSR标记的类型

按照重复单位的碱基数可将微卫星分为1～6核苷酸重复类型，其中二核苷酸重复有4种类型：(AT)n／(TA)n、(AG)n／(TC)n、(AC)n／(Gt)n、(GC)n／(CG)n；三核苷酸重复有10种类型：(AAT)n)/(TAT)n、(AAG)n／(TCT)n、(AAC)n／(TGT)n、(ATG)n／(TCA)n、(AGT)n／(TAC)n、(AGG)n／(TCC)n、(AGC)n／(TGC)n、(ACG)n／(TCG)n、(ACC)n／(TGG)n、(GGC)n／(CGC)n；四核苷酸重复类型有32种(Jurke，1995)。所有类型的微卫星中以单核苷酸重复和二核苷酸重复的微卫星在基因组中出现的频率最高。同一重复类型中不同的碱基重复多态性也不一致。

另外，Weber(1990)按照微卫星核心序列结构的不同将微卫星标记分为三种类型：(1)完全型(perfect)，指核心序列以不间断的重复方式构成的微卫星；(2)不完全型(imperfect)，指在微卫星的核心序列之间有几个非重复碱基，但其两端的连续重复的核心序列重复次数大于3；(3)复合型(compound)，指两种或两种以上的串联核心序列由几个连续的非重复碱基分隔开，但各种连续性的核心序列重复次数不少于5。

1．3 SSR的功能

SSR在真核生物基因组中的功能一直存在争议。在植物基因组中，大多数串联重复序列是非编码的，所以长期以来人们一直认为SSR是一类“垃圾”DNA，是转录哑区，没有明确的生理功能。随着研究的深入，有关SSR功能的资料在不断积累。总的来说，SSR的功能主要有以下几个方面：有些SSR(通常为4～7个碱基重复型)存在于结构基因的转录区，并且编码氨基酸；染色体末端的SSR有保护DNA完整性，避免降解、融合及丢失的功能；位于DNA调控区的SSR有提高或降低临近基因转录速率的作用；SSR区可能是基因重组的热点，是基因变异的来源；部分SSR具有产生转录启动复合物或活化染色体的功能。所以人们相信，尽管大多数SSR确实没有明确的生理功能，只是采取了某种策略来确保自身存活，但部分SSR序列确实是功能基因的一部分。

目前，已知至少有10种以上的人类遗传疾病都与微卫星序列的突变有关。在引起这些疾病的相关基因附近、内含子或外显子中，一般含有三核苷酸微卫星序列，其中患者中所携带的这些微卫星序列往往不稳定，而且长度通常比正常人的更长。在植物中也发现了一些性状与微卫星序列长度变化密切相关。例如，水稻6号染色体上的Wx基因编码一种淀粉合成酶，它与水稻胚乳中直链淀粉的合成有关。在Wx基因的5’非转录区有1个微卫星序列(CT)n，该序列的长度与不同品种的直链淀粉含量高低具有明显的相关性。一般认为，微卫星序列可能在基因的表达调控、染色体结构、染色体重组、新基因的起源及演化等方面有着重要的意义。

1．4 SSR标记的引物来源

微卫星DNA分析成功与否的关键因素有两个，一是PCR扩增的效果，另一个就是侧翼序列引物的来源。一般来说，微卫星扩增的引物来源有四个：一是直接应用已发表的微卫星DNA引物；二是使用近缘种的引物；三是通过筛选DNA序列数据库，或筛选克隆文库的简单重复DNA序列，借助于计算机软件进行引物设计；四是最好也是最根本的方法，即构建基因组文库，再根据微卫星位点两翼的序列来设计引物。