转基因 Cry1C 试剂盒

【原理】
转基因 Cry1C 试剂盒系用特异性抗 Cry1C 单抗包被的微孔板和酶标记抗 Cry1C 单抗，双抗体夹心法检测 Cry1C 基因表达产物，可以高灵敏度和特异性的检测转基因植物中的 Bt-Cry1C 蛋白。

【试剂盒组份（规格）】
预包被板（抗 Cry1C 单抗）             12 孔×8
Cry1C 酶标抗体                      12 ml×1 瓶
20×浓缩洗涤液                      30 ml×1 瓶
5×抽提液/稀释缓冲液                30 ml×1 瓶
底物液 A                            7 ml×1 瓶
底物液 B                            7 ml×1 瓶
终止液                              7 ml×1 瓶
使用说明书                          1 份
0ppb 阴性对照                       1ml
3 个不同浓度的标样：
0.6 ppb，2.5 ppb，6.0 ppb           各 1ml

【试剂准备】
试剂盒中的 20×浓缩洗涤液 30 ml 加 570 ml 灭菌 ddH2O 溶解稀释至 1×洗涤液，
5×抽提液（30 ml）加 120 ml ddH2O 稀释至 1×抽提液，4℃存放备用。

【样品准备】
称取约 20 mg 叶片，加 0.5 ml 1×抽提液（使用前 30 min 放置室温）研磨至匀浆，室温放置 30 min，测定前把样品上清液稀释 5-20 倍。
测定茎干和胚乳中的 Bt 蛋白时，样品称取约 40 mg，加 1 ml 1×抽提液研磨。

【ELISA 反应】
1. 依次加 100 μl 阴性对照，标准品（3 个不同浓度的标样： 0.6 ppb，2.5 ppb，6.0 ppb）和待测样品至 96 孔板；
2. 用封口膜盖住 96 孔板，快速摇动平板混匀样品；
3. 37℃恒温箱孵育 30 min；
4. 倒掉 96 孔板中液体，每孔加入 1×洗涤液 250 μl 洗涤微孔板，洗板 5 次，用吸水纸拍干；
5. 按顺序在每个小孔中加入 100 μl Cry1C-酶标抗体，然后重复步骤 2；
6. 37 ℃恒温箱孵育 30 min；
7. 倒掉 96 孔板中液体，每孔加入 1×洗涤液 250 μl 洗涤微孔板，洗板 5 次，用吸水纸拍干；
8. 依次加入 50 μl 底物 A 液，50 μl 底物 B 液，重复步骤 2；
9. 37 ℃恒温箱孵育 10 min，加 50 μl 终止液，充分混匀终止反应，15 min 以内在酶标仪上读取结果。 在 450 nm 为主波长，630 nm 为次波长（或单波长 450nm）下，用空白孔校零，再读取各孔 OD 值。

【注意事项】
1. 测定中需使用的所有试剂和 96 孔板提前 30 min 放置室温温育（否则会影响试验准确性），注意 12 连管必须温育后再从平板上取下，未使用完的预包被板条应置于有干燥剂的封口袋中密封保存；
2. 试剂使用前应充分摇匀；
3. 摇动平板混匀时注意避免样品之间交叉污染；
4. 使用洗涤液漂洗时，洗涤液需要填满每个小孔，进行充分漂洗；
5. 研磨好的样品如果不能一次全部测量，可以暂时在 4 ℃避光保存，但是最好在 24 h 内测定；
6. 结果判读请在反应终止后 15 min 内完成。

【Bt 蛋白浓度计算公式】

Bt 蛋白浓度（μg/g）=